DNA đảm bảo độ tinh khiết -Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp Các bước chính: -Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng các DNA/RNA: cơ học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) là phân tử lưỡng cực kết hợp với protein màng và photpholipid làm phá vỡ màng tế bào và nhân -Bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase và làm biến tính các phân tử protein, các chất hữu cơ, -Tách DNA khỏi các tạp chất khác. | Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic Các phương pháp tách chiết DNA, RNA Các phương pháp phân tích DNA Kỹ thuật PCR và nhóm phương pháp phụ thuộc PCR Lai phân tử Giải trình tự Tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic Yêu cầu: DNA đảm bảo độ tinh khiết Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp Các bước chính: Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng các DNA/RNA: cơ học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) là phân tử lưỡng cực kết hợp với protein màng và photpholipid làm phá vỡ màng tế bào và nhân Bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase và làm biến tính các phân tử protein, các chất hữu cơ, Tách DNA khỏi các tạp chất khác Thu, rửa, và hòa tan DNA Quy trình chung: 1. Phá vỡ tế bào: Nghiền mẫu trong nito lỏng thành bột mịn Xử lý mẫu trong đệm CTAB ở 55-65 C 2. Loại bỏ protein và photpholipid: Ly tâm loại cặn, thu dịch nổi Xử lý với chloroform:isoamil Ly tâm loại bỏ các protein 3. Thu nhận DNA: Tủa DNA bằng isopropanol or ethanol Ly tâm thu tủa DNA và rửa lại bằng ethanol 70% Hòa tan DNA trong TE or nước cất Bảo quản 4C hoặc -20 đến -80 C Vai trò một số chất thông dụng: Nito lỏng: làm cho màng (thành) tế bào cứng, giòn, dễ vỡ. Hạn chế hoạt động của các enzyme phá hủy nucleotide EDTA: Hạn chế các enzyme phân hủy nội bào vì sự liên kết các ion liên quan quá trình xúc tác thủy phân DNA (ion hóa trị 2 Mg, Ca,) Tris: điều chỉnh pH, tránh sự đứt gãy DNA trong môi trường kiềm or acid CTAB (cetryl ammonium bromide): loại bỏ polysacaride hòa tan DNA cao, hiệu quả cao ở 55-65 C. Chloroform: làm biến tính protein và loại bỏ liên kết DNA-CTAB Ethanol (2:1): tủa DNA trong điều kiện có lực ion, nồng độ muối cao isopropanol (2:1) tủa DNA trong điều kiện không có muối, loại bỏ RNA, DNA đứt gãy, RNAse: loại bỏ RNA, Dnase: loại bỏ DNA TE/nước cất: hòa tan và bảo vệ DNA/RNA . Phương pháp tách chiết ADN DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tách nhân gây đứt gãy. DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước . | Các kỹ thuật chủ yếu trong phân tích axit nucleic Các phương pháp tách chiết DNA, RNA Các phương pháp phân tích DNA Kỹ thuật PCR và nhóm phương pháp phụ thuộc PCR Lai phân tử Giải trình tự Tách chiết, định lượng và định tính axít nucleic Yêu cầu: DNA đảm bảo độ tinh khiết Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp Các bước chính: Phá vỡ tế bào (vật liệu ban đầu) giải phóng các DNA/RNA: cơ học, nitơ lỏng, chất tẩy (SDS) là phân tử lưỡng cực kết hợp với protein màng và photpholipid làm phá vỡ màng tế bào và nhân Bổ sung các chất chống các chất hoạt hóa enzyme DNAase và làm biến tính các phân tử protein, các chất hữu cơ, Tách DNA khỏi các tạp chất khác Thu, rửa, và hòa tan DNA Quy trình chung: 1. Phá vỡ tế bào: Nghiền mẫu trong nito lỏng thành bột mịn Xử lý mẫu trong đệm CTAB ở 55-65 C 2. Loại bỏ protein và photpholipid: Ly tâm loại cặn, thu dịch nổi Xử lý với chloroform:isoamil Ly tâm loại bỏ các protein 3. Thu nhận DNA: Tủa DNA bằng isopropanol or ethanol Ly
