GIẢI TRÌNH TỰ GEN

Có 2 phương pháp chính - Phương pháp hóa học Maxam – Gilbert: đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên để xác định trình tự gen nhưng hiện nay không còn được sử dụng phổ biến nữa - Phương pháp Enzyme Sanger Nguyên lý - Sử dụng các chất hóa học cắt đứt sợi DNA lại 1 loại nucleotide đặc hiệu | GIẢI TRÌNH TỰ GEN C¸c ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù gen Cã 2 ph­¬ng ph¸p chÝnh: Ph­¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam – Gilbert: ®©y lµ ph­¬ng ph¸p ®­îc sö dông ®Çu tiªn ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù gen nh­ng hiÖn nay kh«ng cßn ®ù¬c sö dông phæ biÕn n÷a. Ph­¬ng ph¸p Enzyme Sanger 1. Ph­¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert Walter Gilbert Nguyªn lý Sö dông c¸c chÊt ho¸ häc c¾t ®øt sîi DNA t¹i 1 lo¹i nucleotide ®Æc hiÖu Ph©n tö DNA kÐp ®­îc ®¸nh dÊu P32 t¹i ®Çu 5’ T¸ch rêi 2 sîi ®¬n b»ng nhiÖt Xö lý ho¸ häc sao cho chØ cã 1 lo¹i nucleotide bÞ ph¸ huû -> hµng lo¹t ®o¹n DNA cã kÝch th­íc kh¸c nhau ®­îc t¹o thµnh (sö dông c¸c chÊt ho¸ häc kh¸c nhau ph¸ huû 4 lo¹i nucleotide b»ng 4 ph¶n øng riªng biÖt) TiÕn hµnh ®iÖn di c¸c ®o¹n DNA thu ®ù¬c trªn gel polyacrylamide, chØ quan s¸t ®ù¬c ®o¹n cã g¾n P32. §o¹n DNA ng¾n nhÊt cã ®¸nh dÊu phãng x¹ sÏ ch¹y nhanh nhÊt d­íi t¸c dông cña ®iÖn tr­êng. C¨n cø vµo vÞ trÝ c¸c v¹ch quan s¸t ®­îc trªn gel mµ x¸c ®Þnh tr×nh tù c¸c nucleotide. 5’- Treat with chemicals that specifically cleave at a certain base. 4 tubes G-rxn A>G -rxn T>C -rxn C-rxn 5’- 5’- 5’- C The reaction is done such that each strand is cleaved only once C T A G ddNTP Reaction Mix 3’ G C A T T C C A T A G G 5’ MAXAM-GILBERT CHEMICAL SEQUENCING Labeled strand (P32) C C Sequence is read directly autoradiograph of dried sequencing gel Ph¸ huû c¸c nucleotide Trong ph­¬ng ph¸p nµy sö dông 5 ph¶n øng c¬ b¶n: Dimethylsulfate ë pH sÏ lµm thay ®æi Guanine (G). Piperidine formate ë pH sÏ ph¸ vì cÇu nèi glycoside gi÷a deoxyribose víi purine (G,A) Hydrazine: më c¸c vßng pyrimidine (C , T) Hydrazine khi cã NaCl chØ cã t¸c dông ®èi víi C NaOH ë 900C sÏ ph¸ huû A m¹nh vµ C kÐm. KÕt qu¶: Dimethylsulfate at pH -----------> G Piperidine formate at pH -------> G and A Hydrazine ------------------------------> C and T Hydrazine in M NaCl -----------> C N NaOH at 90 oC -----------------> A and C 5’GACGTACTTA3’ G G+A T+C C A>C N NaOH at 90 oC A>C Hydrazine T+C Piperidine formate | GIẢI TRÌNH TỰ GEN C¸c ph­¬ng ph¸p gi¶i tr×nh tù gen Cã 2 ph­¬ng ph¸p chÝnh: Ph­¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam – Gilbert: ®©y lµ ph­¬ng ph¸p ®­îc sö dông ®Çu tiªn ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù gen nh­ng hiÖn nay kh«ng cßn ®ù¬c sö dông phæ biÕn n÷a. Ph­¬ng ph¸p Enzyme Sanger 1. Ph­¬ng ph¸p ho¸ häc Maxam - Gilbert Walter Gilbert Nguyªn lý Sö dông c¸c chÊt ho¸ häc c¾t ®øt sîi DNA t¹i 1 lo¹i nucleotide ®Æc hiÖu Ph©n tö DNA kÐp ®­îc ®¸nh dÊu P32 t¹i ®Çu 5’ T¸ch rêi 2 sîi ®¬n b»ng nhiÖt Xö lý ho¸ häc sao cho chØ cã 1 lo¹i nucleotide bÞ ph¸ huû -> hµng lo¹t ®o¹n DNA cã kÝch th­íc kh¸c nhau ®­îc t¹o thµnh (sö dông c¸c chÊt ho¸ häc kh¸c nhau ph¸ huû 4 lo¹i nucleotide b»ng 4 ph¶n øng riªng biÖt) TiÕn hµnh ®iÖn di c¸c ®o¹n DNA thu ®ù¬c trªn gel polyacrylamide, chØ quan s¸t ®ù¬c ®o¹n cã g¾n P32. §o¹n DNA ng¾n nhÊt cã ®¸nh dÊu phãng x¹ sÏ ch¹y nhanh nhÊt d­íi t¸c dông cña ®iÖn tr­êng. C¨n cø vµo vÞ trÝ c¸c v¹ch quan s¸t ®­îc trªn gel mµ x¸c ®Þnh tr×nh tù c¸c nucleotide. 5’- Treat with chemicals that specifically .