PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) | TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng PCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang. REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube) 1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 102 103 104 105 106 Cycle 15 Cycle 19 Cycle 23 Cycle 26 Cycle 29 Cycle 31 Cycle 33 Cycle 34 Cycle 36 Cycle 39 Cycle 41 Cycle 13 Cycle 11 1 10 102 103 104 105 106 Mẫu chưa biết [C] Standard curve PHƯƠNG TRÌNH TÍNH SỐ COPY/MẪU Threshold: điểm bắt đầu quan sát được tín hiệu huỳnh quang phát ra, tại thời điểm này tín hiệu do sản phẩm PCR > tín hiệu nền. - Ct (Threshold cycle): là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm khuếch đại vượt qua ngưỡng. Động học RealtimePCR Phân tích tiến trình phản ứng trong mỗi chu kỳ nhiệt nhờ computer THỜI ĐIỂM PHÁT HIỆN TÍN HIỆU REALTIME PCR REALTIME PCR Rael time PCR định lượng số copies trong giai đoạn tăng lũy thừa Log view Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer MgCl2 Real-time PCR MIX Target DNA (Template) Real-time PCR mix Chất phát huỳnh quang 1. Chất nhuộm khi chèn . | TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy Realtime PCR Nguyên tắc và ứng dụng PCR PCR VÀ GIỚI HẠN CỦA PCR PCR và phát hiện sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 1. Phát hiện điểm cuối (End-Point Detection) 2. Độ đặc hiệu kém 3. Độ nhạy thấp 4. Độ phân giải kém 4. Chỉ phân biệt dựa trên kích thước sản phẩm PCR 5. Phải xử lý sau PCR, dễ ngoại nhiễm 6. Chạy gel nhờ Ethidium bromide (chất gây ung thư) REALTIME PCR → Real-time PCR là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kỳ nhiệt. Kiểm soát tín hiệu huỳnh quang phát ra trong mỗi chu kỳ phản ứng (tỉ lệ với lượng sản phẩm PCR tạo thành trong từng chu kỳ nhiệt - Real time). Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang. REALTIME PCR HOẠT ĐỘNG CỦA MÁY REALTIME PCR Kính lọc kích thích Kính lọc phát sáng Nguồn: laser, LED, đèn tungsten-halogen Detector: CCD (charge coupled device), PMT (photomultiplier tube) 1 10 102 103 104 105 106 1 10 102 103 .
