Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau. | GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DNA đó. Vd: 5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTAATAGAACAANAAA3’ 2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA Phương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter Gilbert Phương pháp enzyme giải trình tự của Frederick Sanger (1977) Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) . GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC 1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P). 2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA 3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính Autoradiography Dựa trên nguyên tắc dùng enzyme polymerase để tạo sợi bổ sung từ mồi cho sợi khuôn, nhưng do trong ống phản ứng có thêm các ddNTP, nên mỗi khi men polymerase kéo nhầm ddNTP vào thì sợi bổ sung sẽ bị chặn lại và kết quả là sẽ có các sợi bổ sung với độ dài khác nhau. . GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP ENZYM ddNTP dNTP Bốn phản ứng polymer hoá xảy ra trong 4 ống riêng biệt Tỉ lệ dNTP và ddNTP = 100 : 1 Mồi được đánh dấu T 3’ C G C A G T C C T A G C T T A G C G G 5’ A C G T Áp gel điện di lên phim (mồi đánh dấu bằng phóng xạ hay bằng hoá quang), các vạch điện di trên gel sẽ hiện trên phim. C G G G C G T Sequence 5’ to 3’ MỒI ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ P35 ĐÁNH DẤU ddNTP Sequence-specific primer Gắn ddNTP ngẫu nhiên, khi xẩy ra, p/ứng ngừng. Vì nhiều copy của DNA đích được tạo đồng thời, nên các sản phẩm DNA được tổng hợp mới của tất cả các kích thước đều hiện diện với tận cùng là các ddNTP GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN Dùng gel . | GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DNA đó. Vd: 5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTCCAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGGTCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACGCTTAATAGAACAANAAA3’ 2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA Phương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter Gilbert Phương pháp enzyme giải trình tự của Frederick Sanger (1977) Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) . GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC 1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P). 2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32P bằng hóa chất làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA 3. Điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này
