Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 8 "Các kỹ thuật phân tích trong sinh học phân tử" trình bày những nội dung sau: Tách chiết DNA, tách chiết RNA, phương pháp sắc ký, các phương pháp định tính và định lượng thô nucleic acid, phương pháp điện di, phương pháp định lượng bằng quang phổ kế,. Mời các bạn tham khảo. | Chương 8 Các kỹ thuật phân tích trong Sinh học phân tử 24/03/2016 3:01 SA 1 Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • • • • • Để thu nhận DNA tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước). Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Các nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (DNase và RNase). Sau công đoạn tách chiết, nucleic acid tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với ly tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn. 24/03/2016 3:01 SA 2 Nguyễn Hữu Trí 1 Tách chiết DNA • Bước 1: phá màng tế bào, màng nhân • Bước 2: loại protein • Bước 3: thu hồi nucleic acid 24/03/2016 3:01 SA 3 Nguyễn Hữu Trí Tách chiết DNA • • • Phá màng tế bào, màng nhân: nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS) và proteinase để phá vỡ màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. • Chất tẩy là phân tử lưỡng cực, sẽ kết hợp với protein màng và các phân tử phospholipid làm phá vỡ cấu trúc màng. • Chất tẩy ion hóa có tác dụng phá màng mạnh, chất tẩy không ion hóa có tác dụng phá màng nhẹ hơn. Loại protein: lắc mẫu trong dung dịch phenol:chloroform để biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein bị biến tính không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi li tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform. Thu hồi nucleic acid trong pha nước. Tủa nucleic acid: nhằm thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc để bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme và khi cần có thể hòa lại trong nước theo nồng độ mong muốn. Có thể tủa .
