Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật đọc trình tự (DNA sequencing): Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA. Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố bởi Maxam và Gilbert (1977), Sanger và cs (1977). Cấu trúc của chuỗi DNA là dây xoắn đôi, liên kết với nhau bởi liên kết hidro. Trên mỗi dây có một chuỗi các base, tập hợp của bốn nucleotide : A, T, C, G | Chương 7 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ AXIT NUCLEIC Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật đọc trình tự (DNA sequencing) - Là kĩ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotide hình thành nên phân tử DNA. Các công trình đầu tiên về “DNA sequencing” được công bố bởi Maxam và Gilbert (1977), Sanger và cs (1977). Cấu trúc của chuỗi DNA là dây xoắn đôi, liên kết với nhau bởi liên kết hidro. Trên mỗi dây có một chuỗi các base, tập hợp của bốn nucleotide : A, T, C, G. Kĩ thuật DNA sequencing dựa trên kĩ thuật điện di, sử dụng gel loại polyacrylamide có độ phân giải cao. 2. Phương pháp hóa học (Maxam và Gilbert) Dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử DNA cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học. Trước hết DNA được đánh dấu bằng P32 ở một đầu. Sau đó, chúng được chia thành năm phân đoạn, mỗi phân đoạn được xử lí với một chất hóa học chuyên biệt (có khả năng biến đổi đặc hiệu 1 loại nucleotide) phân cắt DNA ngay tại vị trí có nucleotide bị biến đổi. Kết quả: tạo ra 5 tập hợp, mỗi tập hợp là các oligonuclotide có kích thước khác nhau nhưng đều kết thúc tại cùng một loại nucleotide. Tiến hành điện di trên gel polyacrilamide, vị trí các oligonucleotide tương ứng với kích thước của chúng. Hóa chất Base bị ảnh hưởng Dimethyl sulfate pH 8 G Piperidine formate pH 2 A+G Hydrazine A+ T Hydrazine + 1,5 M NaCl C Nhiệt độ cao (900C), 1,2 M NaOH A >C Các hóa chất sử dụng trong xử lí các base chuyên biệt Giải trình tự một đoạn oligonucleotide theo phương pháp hóa học 3. Phương pháp enzyme học của Sanger thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotide. Dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn cần xác định trình tự. Sử dụng 4 loại nucleotide thông thường + 4 dideoxynucleotide. Dideoxynucleotide là deoxynucleotide, nhóm 3’ OH được thay thế bằng H2 Khi các Dideoxynucleotide bắt cặp bổ sung với nucleotide tương ứng trên mạch gốc thì phản ứng tổng hợp ngừng lại do không tạo được liên kết phosphodister. Nguyên tắc của phương pháp giải trình tự theo Sanger Giải trình tự một đoạn oligonucleotide theo phương pháp enzyme học 4. Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger Xác định trình tự bằng máy tự động: Trong kĩ thuật này, không dùng các đồng vị phóng xạ, thay vào đó là các hóa chất có khả năng phát huỳnh quang (fluochrome). Mỗi loại Dideoxynucleotide được đánh dấu bằng fluochrome có màu khác nhau. Tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại Dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. Điện di kết quả được đọc nhờ hệ thống vi tính Kết hợp phương pháp PCR và sử dụng các Dideoxynucleotide Chỉ sử dụng khi vùng cần xác định trình tự đã được biết trước, và trong phát hiện đột biến điểm.
