DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi | Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. 2. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: - DNA bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu ) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng) Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) Nhiệt độ cần cho sự bắt cặp mồi với DNA mạch khuôn là Ta (Ta thấp hơn Tm khoảng 50C). Bước 3: Kéo dài (elongation) Nhiệt độ được tăng lên đến 720C, để DNA polymerase hoạt động kéo dài mạch. 3. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR DNA mẫu: - DNA sạch, lượng DNA sử dụng cho PCR có khuynh hướng giảm (khoảng 100 ng) - Giảm lượng mẫu hạn chế sản phẩm “kí sinh”. - PCR có thể thực hiện trên các mẫu không được bảo quản tốt. Enzyme : Enzyme polymerase đầu tiên chịu nhiệt được tách chiết từ Thermus aquaticus là Taq polymerase. Enzyme Pfu DNA polymerase thu nhận từ vi khuẩn Pyroccus furiosus có khả năng chịu nhiệt cao hơn, có hoạt tính 3’-5’ exonuclease. Tth polymerase, tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng phiên mã ngược khi có RNA và Mn2+, khi có DNA và Mg2+ thì enzyme này thực hiện khuếch đại DNA. Mồi và nhiệt độ lai Ta - Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Khi thiết kế mồi cần chú ý: thành phần GC, khả năng bắt cặp bổ sung giữa “mồi xuôi” và “mồi . | Chương 5 PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nguyên tắc của phương pháp PCR: DNA polymerase thực hiện tổng hợp mạch mới từ DNA mạch khuôn cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt. Mồi: đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn. Nhiệt độ nóng chảy của mồi: Tm (ở nhiệt độ này, 50 % DNA mạch đôi bị tách mạch thành mạch đơn). Tm = 4(G + C) + 2(A + T) °C Nếu cung cấp 2 mồi chuyên biệt (mồi xuôi và mồi ngược) bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, DNA polymerase sẽ xúc tác tổng hợp đoạn DNA nằm giữa 2 mồi. 2. Phản ứng PCR: Thành phần phản ứng: - DNA bản mẫu - Mồi xuôi và mồi ngược - dNTP (gồm 4 loại: dATP, dGTP, dTTP, dCTP) - MgCl2 - Enzyme polymerase (Taq polymerase, Pfu ) - Dung dịch đệm. - Nước cất 2 lần (đã khử trùng) Các bước của phản ứng: Là một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Bước 1: Biến tính (denaturation) DNA được biến tính ở nhiệt độ cao, thường là 94 – 950C, trong thời gian 30s – 1 phút. Bước 2: Bắt cặp mồi (hybridization) .
