Sử dụng hỗn hợp enzym để phân giải thành tế bào giải phóng các tế bào trần, tạo môi trường mới có áp suất thẩm thấu thích hợp tránh nước vào làm vỡ tế bào | Công nghệ tế bào thực vật Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần HÀ NỘI 03/2011 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÀNH TÂY Khoa công nghệ nông – thực phẩm Thảo luận Nuôi cấy và dung hợp tế bào trần Gv hướng dẫn : ths. BÙI VĂN THẮNG Nhóm sinh viên thực hiện : 1. DƯƠNG TUẤN BẢO 2. NGUYỄN VĂN SINH 3. NGUYỄN ĐÌNH CÔNG 4. HÀ HUY HUÂN 5. QUẢN TRỌNG LÂN 6. LÊ VĂN LÂM 7. PHẠM CÔNG HÀ THẾ TÙNG MẠNH TUẤN NGỌC THỊNH 2 Nội Dung Phương pháp tách protoplast Nuôi cấy protoplast Phương pháp Dung hợp protoplast dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast 3 pháp tách tế bào trần nguyên tắc Sử dụng hỗn hợp enzym: xenlulolaza, emixelulolaza, pectinlaza để phân giải thành tế bào giải phóng các tế bào trần Tạo môi trường có áp suất thẩm thấu thích hợp tránh nước vào làm vỡ tế bào. 4 1. Phương pháp tách tế bào trần các bước tiến hành Chọn nguyên liệu Xử lý gây co nguyên sinh chất Xử lý hỗn hợp enzym Tách và làm sạch protoplas Kiểm tra khả năng sống và tạo mật dọ thích hợp 5 6 2. Nuôi cấy protoplast phát sinh hình thái Có 2 con đường : phát sinh cơ quan (organogenesis) Phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis) 7 2. Nuôi cấy protoplast Môi trường nuôi cấy Ammonium nitrate Calcium Chất hữu cơ Các acid hưu cơ và vitamin Chất điều tiết sinh trưởng Đường 8 2. Nuôi cấy protoplast Điều kiện nuôi cấy Cường độ ánh sáng Chất lượng ánh sáng Nhiệt độ 9 pháp dung hợp protoplast Dùng hóa chất Xử lý bằng NaNO3 Xỷ lý bằng PEG 10 pháp Dung hợp protoplast xử lý bằng NaNO3 Power và cs đã dùng NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hóa mạnh như protoplast từ nhu mô lá. Tác nhân PEG (polyethylen glycol) PEG có 2 tác dụng: Hoạc cung cấp một cầu nối Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau Hoạc dẫn đến sự rối loạn tích diện bề mặt xử lý bằng PEG 11 pháp Dung hợp protoplast 12 pháp Dung hợp protoplast Dùng xung điện Nguyên tắc : các protoplast tích điện nên dịch chuyển trong điện trường tạo chuỗi giữa hai thanh điện cực, xung điện làm thủng màng khiến protoplast hòa trộn vào nhau 13 pháp Dung hợp protoplast 14 15 pháp Dung hợp protoplast các khả năng xảy ra khi dung hợp 16 dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast ứng dụng : Dung hợp protoplast (lai soma) Chọn dòng tế bào Biến nạp, di truyền : chuyển cơ quan tử , AND ngoại lai vào protoplast 17 dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast nuôi cấy tế bào protoplast thuốc lá Chuẩn bị môi trường : + Onozuka cellulase R10 0,5 % + Onozuka macerozyme R10 0,1 % + Mannitol 13,0 % + pHmôi trường ~ 5,8 Dung dịch này được khử trùng bằng màng lọc Millipore loại có đường kính lỗ lọc 0,2-0,25 µm. 18 dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast 19 dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast Tiến hành: Ngày thứ 1: ngâm lá trong dung dịch enzym tách protoplast. Ngày thứ 2: lọc, tách tế bào protoplast, nuôi cấy qua đêm ở 28oC Ngày thứ 3 : chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng yếu (10-20 ) Ngày tứ 5 : chuyển sang nuôi cấy ở ánh sáng có cường độ cao hơn (50-75 µmol/sec/m2) Ngày thứ 7: kiểm tra số lượng tế bào phân chia, kiểm tra xem có dấu hiệu của sự nhiễm bẩn không. 20 nuôi cấy tế bào protoplast thuốc lá dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast Cây cà chua lai khoai tây (pomato) 21 dụng và các tồn tại của kỹ thuật protoplast các tồn tại của kỹ thuật protoplast Các quy trình nuôi cấy tế bào phức tạp, yêu cầu các thiết bị cao. Nhiều cây trồng khác việc tái sinh protoplast là khó khăn thậm trí không thể xảy ra. Tỷ lệ cây tái sinh bất thụ từ các tế bào lai soma nhiều trường hợp còn cao. Khả năng ứng dụng của lai soma vào lai xa còn han chế do có thất thoát NST của thể tái sinh. 22 1 23
