. . Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc. Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo. Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E. coli. | II III III II III nm cDNA sợi đôi F F Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow F Bổ sung linker thứ nhất . Cắt bằng nuclease S1 Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow hoặc bằng DNA polymerase của bacteriophage T4 II III III II III III M Bổ sung linker thứ hai Ệ Ệ Ệ III III m il III ỈIỈ MỆ Ệ Ệ Ệ Cắt bằng enzyme hạn chế . Gắn với plasmid vector I Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Hình . Tạo dòng cDNA bằng cách bo sung tuần tụ các linker nhân tạo. Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc. Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo. Cuối cùng đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E. coli. Công nghệ DNA tái tổ hợp 142 Cấu trúc chóp 5 cDNA sợi thứ nhất Tổng hợp cDNA sợi thứ nhất bằng primer-adapter sợi đơn mRNA A AA A n AAAAAAAAAA A AA CCCCCCCCCC------------------ T nCAGCTGAGG 3 5 Thủy phân RNA và bổ sung đuôi đồng trùng hợp vào đầu 3 của sợi cDNA thứ nhất bằng cách dùng terminal transferase Tổng hợp cDNA sợi thứ hai bằng primer-adapter sợi ra nhiều vị trí cắt hạn chế ở đầu tận cùng cDNA 5 3 GGAGTCGACGGGGGGGGGG A nGTCGACTCC CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC T nCAGCTGAGG 3 5 Sail Sail 5 1 J A r-rr r 3 GGAGTCGACGGGGGGGGGG A nGTCGACTCC CCTCAGCTGCCCCCCCCCCC T nCAGCTGAGG 3 J ỉ 5 sail san Cắt sợi cDNA bằng pTCGAC G n -------------------- A nG RE thích hợp và gắn _ _ nó vào vector G C n------------------- T nCAGCTp Hình . Tổng hợp cDNA SOT đôi bằng phirong pháp primer-adapter Đoạn cDNA được tổng hợp theo phương pháp trên khi gắn vào trong các vector biểu hiện như Âgt20 và Âgt22 chỉ có 1 6 cơ hội biểu hiện trong vi khuẩn lý do chỉ một nửa các phân tử cDNA được đưa vào trong vector theo hướng chính xác đối với promoter lacZ và chỉ một trong ba phân tử được gắn ở hướng phải sẽ ở trong khung đọc chính xác để sản xuất .
