(anchored PCR), kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo (ví dụ: dA) kia (chưa biết trình tự). Sau đó đoạn oligo(dT) (Hình ). (inverse PCR), đ với đoạn hạn chế nhờ enzyme DNA ligase đoạn đã ). | Có ba kỹ thuật PCR thông dụng PCR chuẩn PCR mỏ neo và PCR đảo ngược. Trong PCR chuẩn standard PCR DNA khuôn mẫu được mở xoắn kép sau đó hai primer tác động ở hai đau sợi đon rồi DNA mới được tổng hợp nhờ Taq pol với 4 loại deoxyribonucleotide Hình . Pa DNA khuôn mẫu Biến tính Taq polymerase Pa và Pb là các primer đặc hiệu Pb Hình . Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn PCR mỏ neo anchored PCR kỹ thuật này yêu cầu chỉ cần biết trình tự nucleotide ở một đầu của khuôn mẫu và gắn một đuôi đồng trùng hợp nhân tạo ví dụ dA vào đầu kia chưa biết trình tự . Sau đó đoạn DNA được khuếch đại nhiều lần nhờ một primer có trình tự đã biết trước và một primer thứ hai có oligo dT Hình . PCR đảo ngược inverse PCR được dmg để khuếch đại các đoạn phân tử kế cận với đoạn có trình tự DNA đã biết trước phân tử DNA này được cắt hạn chế và nối lại nhờ enzyme DNA ligase để tạo thành một vòng tròn có tính chất monomer sau đó đoạn DNA được khuếch đại nhờ hai primer tưong đồng với đầu của trình tự đã biết trước Hình . II. Quy trình PCR 1. Thành phần phản ứng - Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer F và R 52 - Taq pol - 4 loại dNTP - Đệm và các muối khoáng C N1 X N2 3 1 1 Ị 5 DNA khuôn mẫu X trình tự đã biêt Ni và N2 trình tự chưa biêt Ni X N2 I I---- -I A I . Khuêch đại PCR băng primer đặc hiệu của trình tự đã biêt Px và primer đặc hiệu của chuỗi neo Pa N1 X N2 Pa - Px I W I-- I----- 22 1 --1 I Hình . Sơ đồ kỹ thuật PCR mỏ neo 2. Thực hiện phản ứng Dưới đây là ví dụ minh họa cho một phản ứng khuếch đại . Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào eppendorf tube E-tube loại 0 5 mL trộn đều các thành phần sau Đệm 10X PCR Hỗn h 4 dNTP 2 5 mM mỗi loại Primer-F 10 pmol pL Primer-R 10 pmol pL Thêm 1120 tới pL 4 pL pL 2 5 1L 40 pL 53 . Chuẩn bị dung dịch pha loãng của Taq pol Đệmx10 2 pL Taq pol 5 units pL 1 pL Thêm H2O tới 20 pL DNA đã biết Enzyme hạn chế Enzyme hạn che 5 í X ạ Ỵ ị 3. 3 1 5 4 Hình . Sơ đồ kỹ thuật PCR đảo ngược . Bổ sung 5 pL DNA khuôn mẫu .
