Việc phân lập và tinh sạch được các loại protein riêng rẽ có ý nghĩa quyết định đến khả năng tìm hiểu được chức năng của chúng. Mặc dù trong một số trường hợp, chúng ta có thể nghiên cứu chức năng của protein ở dạng hỗn hợp phức tạp, nhưng phần lớn những nghiên cứu này thường dẫn đến những kết luận “mù mờ”. | Trong bước thứ nhất, các phân tử protein được phân đoạn dựa trên điểm đẳng điện của chúng (theo nguyên tắc hội tụ đẳng điện). Theo nguyên tắc này, khi một gradient pH được tạo ra từ đầu này đến đầu kia của bản điện di, thì tại vị trí pH tương ứng làm trung hòa điện tích của một phân tử protein sẽ làm các phân tử protein tập trung (hội tụ) tại vị trí đó. Trong bước thứ hai, các phân tử protein tại điểm hội tụ được tiếp tục phân tách trên cơ sở khối lượng và kích thước của chúng khi di chuyển trên trường điện di polyacrylamid đã được gây biến tính bởi SDS như mô tả ở trên. Do các phân tử protein được đồng thời phân tách dựa trên hai thuộc tính (điểm đẳng điện và trọng lượng phân tử), nên hàng nghìn loại protein khác nhau có thể được phân tách khỏi nhau trong một thí nghiệm duy nhất. Sau khi được phân đoạn theo phương pháp điện di hai chiều, mỗi loại protein riêng biệt sẽ được đưa vào phân tích khối phổ để xác định chính xác khối lượng phân tử. Như đã nói ở trên, để tăng hiệu quả phân tích, thông thường protein được cắt thành các đoạn peptit nhỏ nhờ sử dụng protease thay cho việc phân tích phân tử protein ở dạng nguyên vẹn có phân tử lượng lớn và cấu trúc phức tạp. Kỹ thuật phân tích MS /MS cho phép giải trình tự chi tiết của các đoạn peptit và xác định phân tử protein.
