27 . Đánh giá . Định tính: phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch (kỹ thuật Ouchterlony) Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Chuẩn bị thạch 1,5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X, đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6,5 cm x 6 cm, dày 3 mm trên tấm phim trong, tạo các giếng trên thạch. Chuẩn bị mẫu Mẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. Mẫu. | 27 . Đánh giá . Định tính phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch kỹ thuật Ouchterlony Mục đích Tìm hiểu khả năng sử dụng phản ứng khuếch tán trên thạch để xác định kháng thể kháng protein tái tổ hợp MBP-VT2eB. Chuẩn bị thạch 1 5 g agarose được làm tan trong 100 ml đệm PBS 1X đun đến khi agarose tan hoàn toàn. Đổ thạch 6 5 cm x 6 cm dày 3 mm trên tấm phim trong tạo các giếng trên thạch. Chuẩn bị mẫu - Mẫu huyết thanh đối chứng thu trước khi tiêm kháng nguyên. - Mẫu kháng huyết thanh chưa pha loãng. - Mẫu protein tái tổ hợp MBP-VT2eB nồng độ 1 588 mg ml được pha loãng theo tỉ lệ 1 8 1 16 1 32. - Mẫu kháng huyết thanh được pha loãng theo tỉ lệ 1 8 1 16 1 32. Thực hiện - đánh giá Hút kháng nguyên và kháng thể vào các giếng tương ứng đặt thạch vào buồng ẩm ở 4oC. Khoảng 24 - 48g sau quan sát đường tủa ép khô thạch và nhuộm với thuốc nhuộm đỏ Ponceau S 0 2 . Sau đó rửa nước và để khô tự nhiên. Hình Phản ứng kết tủa khuếch tán kép trên thạch kỹ thuật Ouchterlony Phản ứng xuất hiện đường tủa ở một trong hai trường hợp a hoặc b . Phản ứng - không xuất hiện đường tủa ở cả hai trường hợp a và b. 28 . Định lượng Phản ứng trung hoà độc tố VT2e trên môi trường tế bào vero . Xác định liều TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 Chuẩn bị độc tố VT2e Vi khuẩn E. coli 0139 K82 H28 có gen quy định độc tố VT2e được nuôi cấy trong môi trường LB ở 37oC lắc 150 vòng phút trong 24g. Dịch nuôi cấy đem ly tâm vòng trong 30 phút. Thu dịch trong để thử độc tố trên tế bào vero. Chuẩn bị tế bào vero Tế bào vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10 huyết thanh bào thai bê FBS 2 mM gentamycin trong các chai nuôi cấy 25 cm2 ở 37oC 5 CO2. Các tế bào được chuyển vào phiến 96 giếng theo các bước sau - Đổ bỏ môi trường trong chai. - Hút 3 5 ml versene 0 2 cho vào chai tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2 trong versene có EDTA sẽ làm phân tách tế bào. - Hút 2 5 ml trypsin 0 5 cho vào chai tráng đều rồi đổ bỏ. Lập lại lần 2 trypsin sẽ loại bỏ protein có .
