Chương 2. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO . Xác định và dòng hóa gen . Chiết suất và tinh sạch DNA từ mô thực vật Có rất nhiều phương pháp tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm gì hoặc chiết xuất loại mô nào. Khuynh hướng chung hiện nay là tìm phương pháp đơn giản nhất, thời gian thao tác ngắn nhất nhưng DNA thu được vẫn có đủ độ tinh khiết và độ nguyên vẹn 50 – 100 KG cần thiết cho các thao tác tiếp theo trong công nghệ gen thực vật như cắt bằng E. | 317 Chương 2. CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT BẬC CAO . Xác định và dòng hóa gen . Chiết suất và tinh sạch DNA từ mô thực vật Có rất nhiều phương pháp tùy theo mục đích sử dụng DNA để làm gì hoặc chiết xuất loại mô nào. Khuynh hướng chung hiện nay là tìm phương pháp đơn giản nhất thời gian thao tác ngắn nhất nhưng DNA thu được vẫn có đủ độ tinh khiết và độ nguyên vẹn 50 - 100 KG cần thiết cho các thao tác tiếp theo trong công nghệ gen thực vật như cắt bằng E giới hạn chạy phản ứng PCR .Muốn thu DNA có chiều dài 100 - KG phải dùng phương pháp điện di có điện trường không liên tục Chiết suất và tinh sạch DNA tổng số Tế bào thực vật được nghiền vỡ trong điều kiện lạnh làm cho DNA được hòa vào đệm chiết SDS sodium dedecyl sulfatc hoặc CTAB celytrimethyl amonium bromide được thêm vào để giúp DNA hòa dễ hơn đầy đủ hơn vào dịch đệm. EDTA có tác dụng gắn chặt các ion Mg là yếu tố cần cho sự hoạt động của nucleotit phân huỷ DNA trong quá trình chiết. Protein được tách khỏi DNA bằng phenol hoặc chloroform Nếu tránh được chấn động xé xoáy quá mạnh có thể thu được DNA với chiều dài 50 - 100 KG. Ngoài ra CTAB còn có tác dụng tách các polysaccarit ra khỏi DNA do chúng có độ hòa tan khác nhau trong môi trường có mặt CATB 1. Chiết suất DNA từ mô thực vật Lá nghiền với đệm chiết CATB có chứa mercabthoethamol. DNA được chiết bằng hỗn hợp cloroform izoamila kết tủa bằng izphopanol sau đó qua 1 số bước để rửa và tinh khiết DNA. 2. Chiết xuất DNA thực vật để chạy PCR Mẫu lá được sử dụng ở lượng rất ít. Quá trình chiết được đơn giảm hóa nhiều để thao tác nhanh và làm cùng 1 lúc nhiều mẫu tuy vậy DNA được chiết ra hoàn toàn đủ độ lớn và độ sạch để chạy PCR tiếp theo. Cắt DNA bằng Enzim giới hạn Các enzim giới hạn Enzim giới hạn là nhóm endonucleoaza chỉ cắt phân tử DNA ở những vị trí có dãy Giáo trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 318 mã nucleotit nhất định mà chúng có khả năng nhận ra. Thuộc tính rất quan trọng này của enzim giới hạn cho phép cắt phân tử DNA ở các vị trí chọn .
