Tham khảo tài liệu 'hộp điện trong công nghệ dna part 30', kỹ thuật - công nghệ, điện - điện tử phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả | . pH của dung dịch phản ứng Giá trị pH 8 3 là tối ưu để sản xuất hiệu quả các sản phẩm phiên mã cDNA hoàn chỉnh. Trong quá trình sản xuất các sản phẩm phiên mã một số đệm đã được thử nghiệm nhưng không tốt hơn đệm . 2. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai Gây biến tính đun sôi thể lai mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của E. coli. Thông thường đầu tận cùng 3 của các cDNA sợi đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc hairpin loop 1 và vì thế có thể được sử dụng để làm mồi primer cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase Hình . Mặc dù người ta đã dự đoán cấu trúc vòng đôi ở đầu tận cùng của các cDNA và cơ chế phát sinh của chúng nhưng hiện tượng tổng hợp sợi cDNA thứ hai vẫn chưa được nghiên cứu một cách hệ thống. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I đã được sử dụng rộng rãi. Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5 3 cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. Nhiều tác giả đã sử dụng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. Mặc dù có tác giả cho rằng AMV reverse transcriptase không thể dùng để tổng hợp sợi thứ hai của cDNA immunoglobulin nhưng thành công của nhiều thí nghiệm dùng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai đã cho thấy việc sử dụng cả hai enzyme đều có thể cho kết quả tốt. DNA polymerase I và reverse transcriptase có thể tạm ngừng hoặc ngừng lại ở các chuỗi khác nhau. Vì vậy các sợi thứ hai được tổng hợp một cách đặc biệt chúng được sản xuất nhờ một enzyme và được mở rộng hoàn toàn nhờ một enzyme khác . 5 AAAAAA 3 mRNA Gắn mồi oligo dĩ Rev ers e tra nscri pta se 5r 111111 111111 Tông hạp sợi cDNAthủnhãttrên khuôn mẫu mRNA 3SS3S3S3S3 AAAAAA 3 mRNA 1 1111 1 _ . . . RNaseH C Biẽn tính thế lai mRNA-cDNA sợi cDNA mang vòng cặp tóc DNA polymerase I Tong họp sợi cDNAthử hai 1 1 1 1 1 1 Nuclease SI 3r Đoạn Klenow cDNA sợi đói Hình . Sơ đồ tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu mRNA 3. Cắt vòng cặp tóc nhờ nuclease S1 Sau khi
