Tham khảo tài liệu 'hộp điện trong công nghệ dna part 35', kỹ thuật - công nghệ, điện - điện tử phục vụ nhu cầu học tập, nghiên cứu và làm việc hiệu quả | Hình . Vector pAS1. Vector pAS1 là một plasmid dài khoảng 5 8 kb mang promoter PL của bacteriohage và vị trí cắt hạn chế duy nhất BamHĨ định vị ở codon khởi đầu ATG của gen cII của bacteriophage . Plasmid này có nguồn gốc từ pKC30 trong đó gen cII của bacteriophage được chèn vào ở vị trí Hpal. Gen CĨĨ sau đó được cắt bỏ bởi enzyme exonuclease cho tới khi chỉ còn lại codon khởi đầu ATG G của ATG là nucleotide đầu tiên của vị trí Bam HI . Để biểu hiện gen bị mất codon khởi đầu pAS1 được cắt bằng BamHĨ và sau đó xử lý với enzyme mung-bean nuclease hoặc nuclease S1 để loại bỏ đầu lồi đầu tận cùng sợi đơn . Gắn DNA đầu bằng này với đoạn DNA đầu bằng bắt đầu với codon thứ hai của gen được biểu hiện đặt gen đó trong khung với ATG. Các gen được chèn vào theo kiểu này được điều hòa bằng cách chuyển plasmid tái tổ hợp vào trong thể tiềm tan mẫn cảm nhiệt độ của bacteriophage cIA857 . Các tế bào sinh trưởng tới pha log muộn ở 30oC và sau đó nâng lên 40oC để bất hoạt gen ức chế repressor và mở promoter PL. Gen được chèn vào cũng có thể được điều hòa bằng hoạt động của protein N ở nutL và nutR để ngăn cản kết thúc ở tR. Hiệu suất dịch mã của mRNA chịu sự chi phối của một vài yếu tố - Mức độ bổ sung giữa chuỗi SD và đầu 3 của 16S rRNA. - Khoảng cách giữa chuỗi SD và codon AUG để chuỗi DNA của eukaryote định vị. - Nucleotide theo sau AUG ảnh hưởng sự liên kết ribosome. Đưa codon ATG vào trong gen được tạo dòng và duy trì vị trí liên kết ribosome RBS của vi khuẩn bằng cách dùng vector pAS1 Hình . Vector pAS1 mang promoter PL và RBS của gen cII của bacteriophage codon khởi đầu ATG được dung hợp trực tiếp với phần mã hóa đầu tận cùng amino của gen eukaryote muốn biểu hiện. Cách làm này có thể hạn chế việc tối ưu khoảng cách giữa chuỗi SD của vi khuẩn và codon khởi đầu ATG của gen eukaryote để có được sự biểu hiện hiệu quả của gen. Đoạn DNA có gắn promoter và chuỗi SD sau đó được biến nạp vào các chủng E. coli thích hợp. Sàng lọc thể biến nạp để thu các khuẩn lạc có mức độ .
