Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 2

17 3.1. Phương pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81) 1) Trong khi điện di DNA trong gel agarose (có ethidium bromide trong gel hoặc pha trong dịch đệm điện di), quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đó đã phân li hoàn toàn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE 81 vào đó. 2) Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện. 3) Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel, cho vào ống Eppendorf 0,5. | 1 7 3.1. Phương pháp sử dụng giấy DEAE DE 81 1 Trong khi điện di DNA trong gel agarose có ethidium bromide trong gel hoặc pha trong dịch đệm điện di quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đó đã phân li hoàn toàn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE 81 vào đó. 2 Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện. 3 Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel cho vào ống Eppendorf 0 5 ml đã được chọc thủng ở đáy hoặc ống bơm tiêm 1 ml rồi lắp vào trong một ống li tâm lớn hơn như ống Eppendorf 1 5 ml đối với ống 0 5 ml hoặc ống li tâm 10 ml đối với bơm tiêm 1 ml rồi cho vào đó một lượng dung dịch đệm TAE có 50 mMNaCl quay li tâm và lặp lại 3 lần như vậy để rửa sạch. Dung dịch đệm TAE có 50 mM NaCl chứa Tris-HCl 10mM EDTA 1mM NaCl 50mM không hòa tan DNA . 4 Thêm 100 11 TE chứa NaCl 1M quay li tâm nhẹ rồi để yên cho ngấm đều vào giấy DE khoảng 5 phút sau đó li tâm lại làm cho dung dịch đệm thoát xuống hết. Lặp lại ba lần để cho DNA thoát hết khỏi giấy DE theo dung dịch đệm. 5 Chiết xuất bằng phenol và bằng chloroform mỗi thứ một lần để loại bỏ tạp chất rồi kết tủa bằng ethanol ba lần mỗi lần đều kết tủa ở nhiệt độ -70 C rồi quay li tâm thu hồi. 3.2. Phương pháp thu hồi bằng điện di 1 Xác nhận các băng DNA bằng UV với gel đã nhuộm ethidium bromide rồi cắt băng DNA đích đã hoàn toàn phân li khỏi gel. Cho mẫu gel đó vào túi thẩm tích đã buộc kỹ một đầu để cho dung dịch đệm ngấm đều rồi kẹp đầu còn lại. 2 Đặt túi thẩm tích vào chậu điện di nằm ngang sao cho hướng điện di vuông góc với túi thẩm tích. 3 Cứ để vậy mà điện di với điện áp 100 - 200 V soi dưới UV xác nhận băng DNA đã thoát hết ra khỏi gel. Để tăng độ thu hồi cần điện di ngược chiều vài phút cho DNA đã bám vào túi thoát ngược trở lại dung dịch rồi mở túi hút hết dịch ra nhưng cần tránh hút gel cho vào ống nghiệm chiết xuất bằng phenol và chloroform rồi kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. 1 8 3.3. Phương pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền từ gel polyacrylamide