Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 5

71 thêm vào đó 0,1, 0,3, 1,0 3,0 và 10 đơn vị Sau 3A, ủ một giờ. 2) Làm lạnh ở trong nước đá, thêm EDTA cho đến 20 mM để dừng phản ứng. Điện di 3 µg DNA trong gel agarose 0,4%. 3) Chọn chế độ xử lý với lượng Sau 3A cho nhiều đoạn DNA có phân tử lượng 15 - 20 kb nhất. 1.3. Điều chế đoạn DNA để đưa vào tổ hợp 1) Cắt lượng 200 µg DNA có phân tử lượng lớn với nồng độ Sau 3A đã chọn, bên cạnh hai nồng độ Sau. | 7 1 thêm vào đó 0 1 0 3 1 0 3 0 và 10 đơn vị Sau 3A ủ một giờ. 2 Làm lạnh ở trong nước đá thêm EDTA cho đến 20 mM để dừng phản ứng. Điện di 3 L.lg DNA trong gel agarose 0 4 . 3 Chọn chế độ xử lý với lượng Sau 3A cho nhiều đoạn DNA có phân tử lượng 15 - 20 kb nhất. 1.3. Điều chế đoạn DNA để đưa vào tổ hợp 1 Cắt lượng 200 L.lg DNA có phân tử lượng lớn với nồng độ Sau 3A đã chọn bên cạnh hai nồng độ Sau 3A lượng lớn hơn 1 5 lần và nhỏ hơn 0 7 lần . 2 Làm lạnh ở 0 C thêm cho đạt 20 mM EDTA để dừng phản ứng. 3 Lấy 3 U g để điện di trong gel agarose 4 . 4 Chọn sản phẩm chứa nhiều đoạn DNA có độ dài thích hợp thực hiện li tâm phân đoạn trong các ống chênh lệch mật độ đường. 5 Chọn các phân đoạn có độ dài 15 - 20 kb di động chậm hơn MW marker chút ít do nồng độ muối cao thêm vào đó 2 lần TE và carrier RNA cho dễ kết tủa kết tủa bằng ethanol. 6 Kiểm tra lại phân tử lượng của các đoạn DNA bằng cách điện di trong gel agarose bên cạnh DNA MW marker. 1.4. Ligation kết nối 1 Thông thường thiết lập phản ứng với các trường hợp kết nối DNA vector và DNA mẫu với một số tỷ lệ nồng độ khác nhau để tăng khả năng hình thành những tổ hợp kết nối thích hợp. Đồng thời cũng nên thiết lập phản ứng kết nối khống với chỉ DNA mẫu không có DNA vector . Phản ứng chính có thể thực hiện trong ống Eppendorf với tổng lượng 10 LIl chứa những thành phần sau 2 Llg DNA vector 1 ug DNA mẫu 1 pl dung dịch đệm kết nối ligation buffer 10X 100 đơn vị T4 ligase thêm nước cho đủ 10 pl. Các thí nghiệm kết nối khống có lượng bằng 1 2 thí nghiệm chính. Dung dịch đệm kết nối 10x được bán kèm với enzyme T4 ligase . 2 Ủ 14 C trong 1 đêm. 3 Lấy 2 pl dịch từ mỗi ống pha với 5 pl nước và 2 pl dung dịch màu tải mẫu 6 và điện di trong agarose xác nhận sự kết nối độ dài DNA vượt quá 50 kb . 72 1.5. in vitro packaging 1 Lấy SE Sonic Extract và FTL Freeze Thaw Lysate ra khỏi tủ lạnh sâu cho tan chảy ở trong nước đá hay 0 C. Các dịch này thường đựng trong ống nhỏ với lượng đủ dùng . 2 Thêm 3 pl dịch phản ứng chính nêu ở mục .