Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 6

89 Dung dịch hybridization chứa 1,5 ml NaCl 5M, 0,1 ml Tris-HCl 2M (pH 8,0), 0,05 ml EDTA 0,5M, 1 ml dung dịch Denhardt 10×, 1ml SDS 10%, 0,5 ml DNA cá hồi đã biến tính 1 mg/ml và mẫu dò đánh dấu bằng 32P đã biến tính 1 - 3×107 cpm, tổng 10 ml. Dung dịch Denhardt 10× chứa 2% BSA fraction V, 2% polyvinyl pyrrolidone và 2% ficoll 400 (Pharmacia); sử dụng BSA thường gặp nấm mốc nên khi dùng mới pha, bảo quản ở tủ lạnh chỉ được 1 tháng. Chú ý: Một số màng lọc như. | 89 Dung dịch hybridization chứa 1 5 ml NaCl 5M 0 1 ml Tris-HCl 2M pH 8 0 0 05 ml EDTA 0 5M 1 ml dung dịch Denhardt 10 1ml SDS 10 0 5 ml DNA cá hồi đã biến tính 1 mg ml và mẫu dò đánh dấu bằng 32P đã biến tính 1 - 3 107 cpm tổng 10 ml. Dung dịch Denhardt 10X chứa 2 BSA fraction V 2 polyvinyl pyrrolidone và 2 ficoll 400 Pharmacia sử dụng BSA thường gặp nấm mốc nên khi dùng mới pha bảo quản ở tủ lạnh chỉ được 1 tháng. Chú ý Một số màng lọc như Gene Screen Plus. cần phải lai tiền khởi prehybridization 8 giờ. Có thể tái sử dụng màng lọc nylon như Nitran của S S. khi đó ngâm màng trong NaOH 0 2N ở nhiệt phòng trong 2 giờ loại bỏ mẫu dò không có tương tác bổ sung rửa nước cho sạch rồi trung hòa bằng dung dịch chứa 0 2 M Tris-HCl pH 7 2 và 0 1 SDS. Ngâm trong túi polyethylene chứa dung dịch prehybridization trong 2 giờ ở 65 phút rồi bảo quản ở tủ lạnh bảo quản được lâu trong buồng lạnh sâu. Khi dùng lấy ra cho ấm ở 65 C rồi thực hiện từ bước lai hybridization . 3. Lai gel khô Do thiết bị tổng hợp DNA ngày càng phổ biến việc sử dụng DNA tổng hợp làm mẫu dò cho lai Southern ngày càng trở nên có thể. Trong những trường hợp đó không cần sử dụng màng mà có thể sử dụng gel trực tiếp để lai với cảm độ cao và ngày càng trở nên phổ biến. Các bước có thể tiến hành như sau 1 Chế gel agarose 1 thông thường 0 6 - 8 . Khi đó đổ lớp gel hơi mỏng hơn thông thường ít nhiều chỉ khoảng 3 - 5 mm . Điện di với điện áp cao hơn hay thời gian kéo dài hơn so với gel có nồng độ agarose thấp hơn xử lý kiềm và trung hòa gần giống như đối với màng nitrocellulose hay màng nylon. -Xử lý kiềm NaOH 0 5N - NaCl 0 15M nhiệt độ phòng 30 phút -Trung hòa Tris pH 7 0 0 5M - NaCl 0 15M nhiệt độ phòng 30 phút. 2 Sau khi điện di nhuộm ethidium bromide chụp ảnh lưu tư liệu nếu cần. Tuy nhiên nếu khi điện di đã cho DNA MW marker phóng xạ như 32P -DNA đã tiêu hóa bằng Hind III rồi thì bỏ qua bước chụp ảnh. 90 3 Đặt tấm gel trên 2 tấm giấy lọc 3MM đậy phía trên bằng một tấm Saran wrap tờ giấy bọc mỏng bằng chất dẻo .