Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ part 8

Để cho phản ứng ở 60 ºC trong 10 phút. 9) Sau phản ứng,chuyển dịch phản ứng (khoảng 1 ml) sang ống loại 10 ml. Thêm vào chai scintilation 0,5 ml dung dịch rửa, xử lý 10 phút ở 65 ºC. Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lý dung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1,5 ml. Dung dịch rửa chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, SDS 1% và EDTA 5mM. 10) Thêm 40 µg proteinase K (nồng độ cuối cùng 25 µg/ml), cho phản ứng xảy ra. | 1 2 5 ứng là 15mM và 1 . Để cho phản ứng ở 60 C trong 10 phút. 9 Sau phản ứng chuyển dịch phản ứng khoảng 1 ml sang ống loại 10 ml. Thêm vào chai scintilation 0 5 ml dung dịch rửa xử lý 10 phút ở 65 C. Sau đó hút dung dịch rửa trộn với dịch phản ứng đã hút ra trước khi xử lý dung dịch rửa. Dịch hỗn hợp thu được khoảng 1 5 ml. Dung dịch rửa chứa Tris-HCl pH 7 5 10mM SDS 1 và EDTA 5mM 10 Thêm 40 U g proteinase K nồng độ cuối cùng 25 U g ml cho phản ứng xảy ra ở 37 C trong 30 phút. 11 Thêm dung dịch NaCl vào dịch phản ứng cho đạt nồng độ 0 1M và 2 5 lần thể tích ethanol để 10 phút ở -80 C cho kết tủa. Quay li tâm 10.000 v ph trong 10 phút thu tủa sản phẩm. Hòa tủa này trong 50 ui TE. TE chứa Tris-HCl pH 7 5 10mM và EDTA 2mM. 4. Hybridization 1 Ngâm màng đã thẩm đốm DNA plasmid bước 2. vào dung dịch run-on assay prehybridization 1 ml cho một màng có diện tích khoảng 20 cm2 trong 4 - 16 giờ ở 42 C. Dung dịch run-on assay prehybridization dịch lai tiền khởi cho run-on assay chứa formamide ở nồng độ 50 sodium phosphate pH 6 5 50mM SSC 5 25 ml SSC 20 trong 100 ml DNA tinh dịch cá hồi biến tính 250 pg ml và Denhardt 1 10 ml dung dịch Denhardt 10 trong 100 ml . 2 Thay bằng dung dịch run-on assay hybridization dịch lai . Tiến hành lai trong 48 giờ ở 42 C. Dung dịch run-on assay hybridization dịch lai cho run-on assay chứa 4 phần dịch run-on assay prehybridization và 1 phần dung dịch dextran sulfate 50 . 3 Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2 và SDS 0 1 ba lần ở nhiệt độ phòng mỗi lần 5 phút. 4 Rửa màng bằng 100 ml dung dịch chứa SSC 2 và SDS 0 1 hai lần ở nhiệt độ 65 C mỗi lần 15 phút. 5 Hong khô gói trong giấy nhựa mỏng Saran wrap thực hiện tự ký phóng xạ. 6 Đọc kết quả dựa vào độ đậm nhạt trên film X-quang. Quá trình phiên 1 2 6 mã của một hệ phiên mã in vitro sau khi phá tế bào nếu tiếp tục diễn ra sẽ tổng hợp RNA có chứa a-32P UTP vì vậy đốm blot tương ứng sẽ cho kết quả phóng xạ dương tính. Run-on assay như vậy chỉ cho ta thấy hệ nào được cảm ứng phiên mã bởi hóa .