Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 3

Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA, trữ mẫu ở -40C hoặc -200C. Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA. | 23 - Cho vào 800pl ethanol 100 và ủ ở -80OC khoảng 30 phút. Thấy DNA kết tủa lơ lửng thành dạng sợi mảnh . - Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên.Thu lấy kết tủa chính là DNA. - Làm khô DNA bằng cách phơi DNA trong 2h ở nhiệt độ phòng và cho vào TE.1X làm hòa tan DNA trữ mẫu ở -40C hoặc -20OC. - Điện di và đọc kết quả. 3.4.5 Quy trình Khuếch đại gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và gen ITS1 - 5.8S - ITS2 của nấm Beaveria Bassiana vuille 3.4.5.1 Nấm Metarrhizium anisopliae Đoạn DNA được khuếch đại theo phương pháp PCR với cặp primer có trình tự cụ thể như sau - METPR1 5 CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3 - METPR4 5 GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3 Nguồn Leger St. 1992 Bảng 3.1 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Metarrhizium Thành phần Nồng độ cuối Thực hút pl - PCR buffer 1X 2.5pl - MgCl2 1.5mM 0.75pl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5pl - METPR1 50ng 1.5pl - METPR4 50ng 1.5pl - Tag DNA polymerase 0.04UI 0.5pl - DNA khuôn 125ng 1pl - Nước cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 LI l 24 Bảng 3.2 Quy trình nhiệt khuếch đại gen Pr1 trên nấm Metarrhizium Các bước Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 5 phút - Số chu kỳ lặp lại 37 chu kỳ - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 570C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút - Kéo dài 720C 6 phút - Ủ 40C 6 phút 3.4.5.2 Nấm Baeuveria Bassiana vuille Đọan DNA được khuếch đại có trình tự primer cụ thể như sau Primer Trình tự 5 -3 ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG Bảng 3.3 Các thành phần trong phản ứng PCR trên nấm Beauveria Thành phần Nồng độ cuối Thực hút pl - PCR buffer 1X 2.5pl - MgCl2 1.5mM 0.75pl - dNTP 200mM mỗi dNTP 0.5pl - ITS 4 50ng 1pl - ITS 5 50ng 1pl - Tag DNA polymerase 1UI 0.25pl - DNA khuôn 100ng 1pl - Nước cất 2 lần vô trùng vừa đủ 25 U l 25 Bảng 3.4 Quy trình nhiệt khuếch đại vùng ITS1 - 5.8S - ITS2 trên nấm Beauveria Các bước Nhiệt độ Thời gian - Tách đoạn DNA 940C 3 phút - Số chu kỳ lặp lại 30 chu kỳ - Tách đoạn DNA 940C 1 phút - Ủ bắt cặp 560C 30giây - Kéo dài 720C 4 phút - Kéo dài 720C 7 phút - Ủ 40C 10 phút 3.4.6