Đang chuẩn bị liên kết để tải về tài liệu:
Giáo trình DNA tái tổ hợp part 3

- Hoạt tính exonuclease 3’ 5’. E. coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA, xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3’ của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs, hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA, hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa (proofreading) bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. nuclease 5’ 3’. E. coli . . | - Hoạt tính exonuclease 3 5 . DNA polymerase I của E. coli cắt các chuỗi nucleotide ở các đầu tự do của DNA xúc tác cho sự thoái biến bậc thang từ đầu 3 của cả DNA sợi đôi và sợi đơn khi không có dNTPs. Trong trường hợp có dNTPs hoạt tính exonuclease trên sợi đôi sẽ bị ức chế bởi hoạt tính polymerase. Trong quá trình tổng hợp DNA hoạt tính exonuclease thực hiện chức năng đọc sửa proofreading bằng cách cắt bỏ những nucleotide lắp ráp sai. - Hoạt tính exonuclease 5 3 . DNA polymerase I của E. coli có thể chuyển chỗ các nucleotide từ phía 5 của điểm đứt và bổ sung tức thời các nucleotide từ phía 3 tạo ra chuyển động của điểm đứt dọc theo DNA. Hoạt tính Phản ứng Cơ chất 5 - 3 DNA polymerase enzyme DNAoh ndNTP - DNA- pdN n nPPi Mg2 Khuôn mẫu DNA sợi đơn đoạn mồi DNA mang nhóm 3 -OH 3 - 5 Exonuclease enzyme dsDNA hoặc ssDNA - 5 pNoH Mg2 DNA sợi đơn hoặc sợi đôi có đầu 3 -OH 5 - 3 Exonuclease enzyme dsDNA 5pNoH 5 pN pN npNoH ssDNA Mg2 DNA sợi đôi hoặc thể lai RNA DNA - ứng dụng chính Đánh dấu đoạn DNA để làm mẫu dò bằng dịch chuyển điểm đứt. Khởi đầu cho sự tổng hợp sợi thứ hai trong tạo dòng cDNA. Xác định trình tự DNA bằng phương pháp dideoxynucleotide. 1.2. Đo Klenow của DNA polymerase I của E. coli Enzyme này có tác dụng lấp đầy các đầu khuyết 3 của DNA sợi đôi. Do DNA polymerase I có ba hoạt tính nhưng hoạt tính exonuclease 5 3 ít sử dụng nên Klenow đã dùng protease để cắt bớt đoạn có hoạt tính đó. Vì Công nghệ DNA tái tổ hợp 9 vậy khối lượng phân tử của enzyme chỉ còn lại 76.000 Da được gọi là đoạn lớn của DNA polymerase I . Hoạt tính Phản ứng Cơ chất 5 - 3 DNA polymerase enzyme DNAoh ndNTP - DNA- pdN n nPPi Mg2 Khuôn mẫu DNA sợi đơn đoạn mồi mang nhóm 3 -OH tự do 3 - 5 Exonuclease enzyme ds hoặc ss DNA 5 pNoH Mg2 DNA sợi đơn hoặc sợi đôi thoái biến từ đầu 3 -OH tự do. Hoạt tính exonuclease trên DNA sợi đôi bị ngăn cản bời hoạt tính polymerase 5 - 3 - Ứng dụng chính Làm đầy đầu khuyết 3 do enzyme hạn chế tạo ra. Đánh dấu đầu tận cùng của các đoạn DNA bằng cách dùng